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ELISA測(cè)定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測(cè)定模式，測(cè)定操作非常簡(jiǎn)單，一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現(xiàn)分述如下：
一、標(biāo)本的收集和保存
用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本zui為常用的是血清（漿），有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測(cè)目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本。目前臨床上使用血清標(biāo)本測(cè)定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和治療藥物等。對(duì)用于激素和治療藥物測(cè)定的血清標(biāo)本的收集，要注意收集時(shí)間甚或體位有可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會(huì)有一峰值出現(xiàn)：生長(zhǎng)激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測(cè)定此類(lèi)激素時(shí)，有必要在密切相連的時(shí)間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測(cè)定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí)，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測(cè)，應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的zui適時(shí)間抽血檢測(cè)。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測(cè)的血清標(biāo)本的收集則沒(méi)有時(shí)間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：
（1）要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類(lèi)似過(guò)氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長(zhǎng)，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
（3）血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在-70℃以下。
（4）冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。
（5）標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。
二、試劑準(zhǔn)備
在實(shí)驗(yàn)室，對(duì)試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問(wèn)題，其直接的后果是對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備zui為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿(mǎn)足測(cè)定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)對(duì)所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時(shí)，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時(shí)配制。
三、加血清樣本及反應(yīng)試劑
在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國(guó)產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致四、溫育
溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
溫育這一步是臨床ELISA測(cè)定中zui容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。通常目前國(guó)內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘～1小時(shí)，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時(shí)才能有較*的結(jié)合，低于1小時(shí)，可能會(huì)影響測(cè)定下限。因此，關(guān)于溫育，在實(shí)際測(cè)定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：
要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，加完樣本和/或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長(zhǎng)，而在臨床實(shí)驗(yàn)室中，很少有人注意這個(gè)問(wèn)題，通常是將微孔板一放入溫箱即開(kāi)始計(jì)時(shí)，這樣就很容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)的問(wèn)題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個(gè)問(wèn)題，就是在每一年的冬季總有那么一個(gè)多月的時(shí)間，在做HBsAg測(cè)定的室內(nèi)質(zhì)控中，測(cè)定由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心供應(yīng)的1 ng/ml弱陽(yáng)性樣本時(shí)，總是測(cè)不出來(lái)，不知原因?yàn)楹危窟@可能就與南方冬天室內(nèi)溫度較低有關(guān)，此時(shí)微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時(shí)間不夠，以致弱陽(yáng)性樣本測(cè)定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間，臨床實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長(zhǎng)時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃，從而適當(dāng)延長(zhǎng)板條在溫箱中的放置時(shí)間。具體的做法是，用一小溫度計(jì)放置板孔反應(yīng)溶液中測(cè)量觀察即可。